Funakoshi品牌的FAOBlue是一款可通過(guò)熒光成像將活細(xì)胞內(nèi)脂肪酸β-氧化（FAO）活性可視化的試劑。只需將產(chǎn)品添加到培養(yǎng)基中，即可通過(guò)熒光觀察定量脂肪酸β-氧化活性。

FAO（脂肪酸β-氧化，F(xiàn)atty acid beta-oxidation）

脂肪酸（FA）是多種脂質(zhì)的基本成分，是細(xì)胞的重要組成部分，同時(shí)也是能量的主要來(lái)源之一。FA降解的主要途徑是通過(guò)線粒體脂肪酸β-氧化（FAO）。FAO 是肝臟、心臟和骨骼肌等器官能量平衡的關(guān)鍵代謝途徑。

FAO是一個(gè)復(fù)雜的生化過(guò)程，涉及多種酶的參與。FAO主要分為以下四個(gè)步驟：

1) 脫氫：脂酰-CoA 被?；鵆oA脫氫酶氧化成烯?；?CoA；

2) 水合：烯酰-CoA-被烯酰-CoA水合酶合成-3-羥基乙酰-CoA；

3) 氧化：3-羥基乙酰-CoA轉(zhuǎn)化為 3-酮酰-CoA；

4) 硫解：3-酮酰-CoA轉(zhuǎn)化為酰基-CoA（Cn-2）和乙酰-CoA。乙酰-CoA進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為ATP。生成的酰基-CoA（Cn-2）進(jìn)入另一個(gè)FAO循環(huán)，進(jìn)一步生成酰基-CoA（Cn-4）。

研究表明，F(xiàn)AO代謝異常與肥胖和非酒精性脂肪肝?。∟AFLD）等多種疾病密切相關(guān)，因此檢測(cè)FAO活性對(duì)于診斷相關(guān)疾病至關(guān)重要。但由于FAO過(guò)程較為復(fù)雜，使得在活細(xì)胞中檢測(cè)FAO活性的方法非常有限。目前只有一些間接方法，如使用含放射性同位素的脂肪酸或測(cè)量耗氧量。

FAOBlue作為首-款直接測(cè)量活細(xì)胞中FAO活性的試劑，只需在培養(yǎng)基中加入FAOBlue，即可通過(guò)熒光成像，簡(jiǎn)單地檢測(cè)出活細(xì)胞中FAO的活性。

FAOBlue原理

FAOBlue是一種具有被乙酰氧甲基酯保護(hù)的壬酸（C9）的香-豆-素染料。在被FAO代謝之前，F(xiàn)AOBlue在405 nm下不會(huì)激發(fā)熒光。FAOBlue的乙酰氧基甲酯可被細(xì)胞內(nèi)的酯酶水解，使FAOBlue可直接穿透細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞，轉(zhuǎn)化為游離脂肪酸（Free FA type）；Free FA type會(huì)轉(zhuǎn)化為Acyl-CoA，并進(jìn)入FAO循環(huán)；Acyl-CoA 經(jīng)過(guò)3次FAO循環(huán)分解為含有丙酸（C3）的非熒光香-豆-素。經(jīng)過(guò)第4次FAO循環(huán)后，香-豆-素染料從丙酸中釋放出來(lái)并擴(kuò)散到整個(gè)細(xì)胞。此時(shí)整個(gè)細(xì)胞內(nèi)的香-豆-素在405 nm下發(fā)出強(qiáng)烈的藍(lán)色熒光，可視化地定量檢測(cè)細(xì)胞中FAO的活性。

產(chǎn)品信息

產(chǎn)品特點(diǎn)

操作簡(jiǎn)單，加入培養(yǎng)基后，孵育30-120min即可觀察熒光；

實(shí)例驗(yàn)證適用于多種細(xì)胞類(lèi)型。

產(chǎn)品應(yīng)用

FAO活性的相對(duì)定量

評(píng)估藥物對(duì)FAO活性的影響

實(shí)驗(yàn)步驟

使用前請(qǐng)先按照說(shuō)明書(shū)中的Reconstitution步驟，用DMSO對(duì)FAOBlue試劑進(jìn)行溶解，制成Stock solution，按照說(shuō)明書(shū)中的要求保存。

以下實(shí)驗(yàn)步驟僅供參考，請(qǐng)按照產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)操作：

1、在新鮮的HEPES緩沖液（HBS）中加入FAOBlue（最終濃度為5-20μM）；

注：可用無(wú)血清培養(yǎng)基代替HBS

2、去除培養(yǎng)基，用HBS清洗細(xì)胞2次；

3、向細(xì)胞中加入含F(xiàn)AOBlue的HBS；

4、在37℃下培養(yǎng)30 min以上；

注：不同細(xì)胞類(lèi)型最佳培養(yǎng)時(shí)間有所不同，建議根據(jù)具體情況而定。

5、用HBS清洗細(xì)胞；

6、通過(guò)成像觀察活細(xì)胞中的藍(lán)色熒光（Ex. 405 nm/Em. 430～480 nm）。

成像指南

激光共聚焦顯微鏡：使用顯微鏡中配備的405 nm激光

落射熒光顯微鏡：激發(fā)濾光片非常重要，建議使用波長(zhǎng)為 390-450 nm的激發(fā)濾光片

應(yīng)用實(shí)例

一、FAOBlue及其香-豆-素衍生物的吸收光譜和熒光光譜

在PBS緩沖液（pH 7.4）中，F(xiàn)AO代謝后釋放的FAOBlue和香-豆-素衍生物的吸收光譜（左）、熒光光譜（右）。

FAOBlue經(jīng)過(guò)FAO轉(zhuǎn)化為香-豆-素衍生物后，吸收峰從FAOBlue發(fā)生偏移至405 nm。因此，在405 nm的激發(fā)條件下，F(xiàn)AOBlue不會(huì)發(fā)出熒光，只有在通過(guò)FAO釋放香-豆-素衍生物時(shí)才會(huì)發(fā)出藍(lán)色熒光。

注：FAOBlue在300-380 nm（最大350 nm）激發(fā)時(shí)顯示藍(lán)色熒光（灰色線，370-450 nm），所以在選擇濾光片時(shí)請(qǐng)格外注意，避免同時(shí)激發(fā)未反應(yīng)的FAOBlue以及FAO反應(yīng)后的香-豆-素衍生物。

二、各種癌細(xì)胞中FAO活性可視化

在4種癌細(xì)胞中加入FAOBlue，培養(yǎng)一定時(shí)間后進(jìn)行熒光觀察。所有細(xì)胞都出現(xiàn)藍(lán)色熒光，而經(jīng)過(guò)FAO抑制劑etomoxir處理后藍(lán)色熒光顯著減少。這些數(shù)據(jù)表明，藍(lán)色熒光是由活細(xì)胞中FAO活性引起的。（注：實(shí)驗(yàn)條件根據(jù)細(xì)胞類(lèi)型不同而不同）

※HepG2 : 5 μM, 30 min、 LNCaP: 20 μM, 120 min、HeLa : 20 μM, 120 min、A549 : 5 μM, 30 min

三、藥物對(duì)FAO活性的干擾

對(duì)HepG2細(xì)胞分別進(jìn)行AICAR（通過(guò) AMPK 激活的 FAO 激活劑）和ranolazine（部分 FAO 抑制劑）處理，隨后加入FAOBlue（5uM）孵育30分鐘。結(jié)果顯示，與對(duì)照細(xì)胞（未處理）相比，AICAR處理后明顯增加藍(lán)色熒光強(qiáng)度，ranolazine處理后則明顯降低藍(lán)色熒光強(qiáng)度。

四、藥物對(duì)FAO活性影響的定量分析

將HepG2細(xì)胞與不同濃度的ND630預(yù)孵育4小時(shí)。ND630處理后，加入FAOBlue（5uM）孵育30分鐘。結(jié)果表明，伴隨ND630濃度增加，藍(lán)色熒光強(qiáng)度隨之增加。由此可知，ND630可增強(qiáng)FAO活性。（注：ND630是乙酰-CoA羧化酶抑制劑，被認(rèn)為是治療非酒精性脂肪肝（NAFLD）的潛在藥物）

五、NASH模型小鼠的FAO活性分析

非酒精性脂肪性肝炎（NASH）是一種與脂質(zhì)相關(guān)的疾病，表現(xiàn)為脂肪酸代謝活性低。向正常小鼠和NASH模型小鼠以口服形式給藥增強(qiáng)脂質(zhì)代謝的bezafibrate后，提取原代肝細(xì)胞。向各組細(xì)胞加入FAOBlue（5 μM）觀察其FAO活性，結(jié)果顯示，相較正常小鼠來(lái)源細(xì)胞，NASH模型小鼠來(lái)源細(xì)胞的FAO活性明顯被抑制。另外，給藥bezafibrate的NASH模型小鼠來(lái)源細(xì)胞中FAO活性被恢復(fù)。

產(chǎn)品文獻(xiàn)

Uchinomiya et al., Chem. Commun., 56, 3023-3026 (2020) Fluorescence Detection of Metabolic Activity of Fatty Acid Beta Oxidation Activity in Living Cells.

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